​细胞鉴定指南 | 单细胞专题

各位亲爱的小伙伴们，下沙小何又来了，这一次我们依旧聚焦单细胞测序：凭借着对生命科学领域划时代且革命性的意义，单细胞测序被越来越多的科学工作者采用来探索生命的奥秘。联川生物作为业内数一数二的科研测序服务商也在不断贡献着自己的力量，并凭借着自身强硬的实力掳获了一大波可爱的客户。但随着业务量的突飞猛进，越来越多的老师来问单细胞数据该如何挖掘，尤其是在单细胞的第一步-细胞鉴定就翻了跟斗。

文章尚未发表，抓头发仍然得继续，炎炎夏日来临，头秃可以让你倍感清凉，但冬天可就不保暖了，怎么办？让下沙小何用自己的经验为大家的护发之旅加把油吧！

何为细胞鉴定，顾名思义就是知道实验中捕获的那么多细胞中每个细胞谁是谁。那么如何快速鉴定细胞呢？

最快的方法是通过marker gene来确定了。那么问题来了，何为marker gene呢？marker基因在我看来，是在一类特定的细胞中特异性表达的或者高表达的基因，也就是说要么这个基因只在目的细胞中表达，要么在别的细胞类型中表达量很低，在目的细胞中表达量很高。

所以如果我们要通过marker gene来进行细胞的鉴定，我们的第一步就是找marker gene。Marker gene要怎么找？一方面，目前有很多公开数据库，比如说cell marker，大家可以通过这些数据库以最快的数据进行marker的查找；

但这些数据库存在一定的缺陷，这些marker很大概率是没有验证过的，可能特异性并不是那么的好，或者是流式用的抗体，存在蛋白和基因表达水平的时空不一致性。所以我们更推荐大家优先用其他方法来进行marker的查找，比如说通过文献。我们一般推荐大家优先看是否有相类似组织的单细胞文章发表，如果有，那么congratulations！你找到捷径了，你就可以直接借用相似组织中的marker进行细胞鉴定；举个例子，假设我做的是人肺癌组织的单细胞测序，那么我会打开pubmed官网，用“lung”+“scRNA”作为关键词来进行搜索，非常幸运，我搜到了一篇名为“Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment”的文章，这篇文章进行了肺癌组织的单细胞图谱分析，并在图中展示了细胞鉴定过程所用的marker以及这些marker的可视化图（如下图），再次congratulations，你所要的marker已经被你找到了，你可以将这些marker 进行收集并整理以供后期的marker可视化；

当然，还有些作者可能相对来说就比较“懒”了，他并没有将这些marker以图片的形式进行展示，而是以文字的形式散落在文章描述当中，那么这个时候就需要你去细细品读了，比如说在下面的这个截图。

此外，大家还要注意的一点是，有些附件中可能列举了所谓的marker gene，并这些差异基因长达上百个甚至上千个。这些其实严格意义上来说是差异基因，也就是一个cluster或者一群细胞相对于其他细胞特异性高表达的基因，这些是不能用来进行细胞鉴定的，如下图：

通过文章阅读，你已经拿到了生肉或者生米了，接下来就要看我们如何化腐朽为神奇，将这些数据利用起来了。这一步叫做marker gene的可视化，通俗点就是通过图像的形式将表达这些基因的细胞拎出来。为了帮广大科研工作者更快的实现单细胞marker gene的可视化，联川重磅推出自研marker基因注释平台：https://www.omicstudio.cn/tool/ten_x/index?id=47，大家可以通过这个云平台实现快速的自主的细胞鉴定，那么肯定有宝宝会问，这个平台怎么用呢？传送门给大家，往期推送对这个工具进行了非常详细的介绍：听说单细胞数据可以在线绘图啦！！！| 单细胞专题。

当大家拿到根据我们云平台可视化的数据后，大家是不是会有疑虑，我该如何来解读这些数据呢？现在我们以云平台的单细胞示例数据作为例子来进行简单的示范：

左边的图为通过云平台后进行marker可视化的结果，右边的图为细胞降维分群的结果。左右图结合来看，我们发现，cluster0，2，3，10高表达CD3E，CD3D和CD3G等marker，说明这些cluster为T细胞。

那么有些同学可能会认为，这样看是不是太累了，得左右来回看，还得大概估计着细胞到底属于哪个cluster，嘿嘿，用最贴心的服务为客户解决科研问题是联川生物一贯的作风，这里我们祭出一个大杀器，dotplot图，直接在图中就可以基因在每个cluster中的表达程度和表达比例，妈妈再也不用担心我的眼花症犯了：

从图中可以看出，cluster0，2，3，10中的细胞表达CD3D，CD3E和CD3G的比例是比较高的（圆点比较大），且表达水平比较高（紫红色比较深），说明这四个cluster都是T细胞，其他细胞的鉴定过程也类似。

根据上面的示例过程，大家可以看出单细胞通过marker来鉴定细胞类型的过程一个需要加入主观意识判断的过程，因此在很多时候，可能大家会对自己的实验结果有一定的怀疑，1个marker gene大家会觉得不太保险或者不太准确进而影响后续的数据分析，因此会用多个marker左右辅证自己的判断，小何理解大家的心情，但是选择越多，越难下判断，因此我们并不推荐大家一上来就10多个marker，这样反而容易有选择困难症。

此外，不知道大家发现了没有？在我们的标准流程结果中，如果大家是人和鼠等模式物种，还有一个叫做singleR results的文件夹，这个是我们非常贴心的为大家先用自动化注释软件singleR进行的智能化细胞定义。机器方便你我他，但有时人工智能一不留神就变成了人工智障。因此，大家需要注意的是，singleR注释的原理是根据细胞的基因表达模式进行比对，一旦一种细胞的表达模式和singleR数据库中收录的细胞类型非常相似，那么就会被注释为数据库中的细胞名，因此便会出现由于肾脏细胞具有较高的代谢强度而被误注释为也具有高线粒体强度的肝脏细胞，因此啊！singleR的结果，只能作为参考，辅助鉴定，不可全信！

但是吧，肯定有人要问了，万一有一种细胞是我这个组织特有的，之前没人做过，而且还没有报道的特异性marker，怎么办，不要慌！我们还有保留节目。这就是根据差异基因富集（KEGG或者GO）的功能通路来看确定细胞类型。打个比方，我们想要在睾丸组织内鉴定成熟精子，但由于某些原因，导致现有的marker可能没办法很好的区分。那么这个时候，我们对每个cluster中特异性高表达的基因进行富集分析后发现，有一个cluster高表达鞭毛蛋白相关基因。结合精子的特点，精子有鞭毛，并且通过鞭毛来进行游动，那么恭喜你，这一群高表达鞭毛蛋白相关的cluster就是你找的精子细胞了！

以上就是细胞鉴定的大致过程，大家还不赶紧实操起来，文章可就在不远的前方了。

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